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以副溶血弧菌生物膜基質(zhì)為靶點(diǎn)，采用96孔板結(jié)晶紫染色法篩選出纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k為單酶，將單酶組合為復(fù)合酶，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化組合酶濃度。通過(guò)結(jié)晶紫染色、菌落計(jì)數(shù)、掃描電鏡等，評(píng)價(jià)組合酶對(duì)304不銹鋼上副溶血弧菌生物膜的抑制作用。響應(yīng)面優(yōu)化得到的組合酶中纖維素酶濃度為1.00 mg/mL，脂肪酶濃度為1.10 mg/mL，蛋白酶k濃度為1.50μg/mL時(shí)生物膜抑制率最大，為89.73%，比優(yōu)化之前的各單酶相比，對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制率有顯著性提高，與預(yù)測(cè)基本相符，說(shuō)明模型擬合良好，組合酶中各單酶濃度準(zhǔn)確可行。優(yōu)化得到的組合酶有效抑制了304不銹鋼上副溶血弧菌生物膜的生長(zhǎng)，抑制率為59.35%，掃描電鏡圖也證實(shí)了復(fù)合酶的抑制效果。生物膜降解酶復(fù)合有效提升了對(duì)生物膜的抑制率，為致病菌生物膜的降解及消除提供了新的思路。

副溶血弧菌屬于嗜鹽性的革蘭陰性菌，可以從海產(chǎn)品如魚、對(duì)蝦、蟹、貝類和海藻中分離得到，是引起食源性疾病的主要致病菌之一。副溶血弧菌污染食品后,，極易引起急性腸胃炎，使人發(fā)生惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者可以引起昏迷、脫水甚至死亡。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌黏附在非生物或生物表面，并被自身分泌的胞外多聚物如蛋白質(zhì)、糖類、脂類、胞外DNA等包裹形成的一種高度組織化、系統(tǒng)化的微生物膜狀結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌在惡劣環(huán)境中為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與浮游狀態(tài)相對(duì)應(yīng)的存在形式。生物膜內(nèi)有細(xì)胞外基質(zhì)包裹的多層細(xì)菌生長(zhǎng)，可避免被宿主防御系統(tǒng)清除，并阻礙大部分抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)。與浮游細(xì)胞相比，形成生物膜的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗能力會(huì)提高，形成生物膜的細(xì)菌具有高度耐藥性和能逃避免疫系統(tǒng)攻擊的特點(diǎn)，使其感染易慢性化并難于控制。因此，開發(fā)有效的控制和去除細(xì)菌生物膜的方法是必要的。

由于生物膜降解酶能分解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)生物膜分離，因此被認(rèn)為是一種新型的、環(huán)保的生物膜控制方法。由于細(xì)菌生物膜基質(zhì)的多樣性，不同生物膜降解酶對(duì)細(xì)菌的作用不盡相同。研究表明，纖維素酶對(duì)玻璃表面銅綠假單胞菌生物膜的形成有部分抑制作用。α-淀粉酶可以有效的清除芽孢桿菌的生物膜，并抑制生物膜的形成。

生物膜降解酶是去除細(xì)菌生物膜的有效途徑，目前關(guān)于不同生物膜降解酶的協(xié)同增效作用缺乏了解。因此，本研究旨在探討脂肪酶、纖維素和蛋白酶K的復(fù)合優(yōu)化，并對(duì)其在304食品級(jí)不銹鋼上副溶血性弧菌生物膜的抑制作用進(jìn)行初步研究。研究結(jié)果有助于控制副溶血性弧菌生物膜的形成，進(jìn)一步為生物膜降解酶的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株

副溶血弧菌VIB461由中國(guó)海洋大學(xué)應(yīng)用海洋微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基及酶

2216E瓊脂、TSB（3%NaCl）肉湯、TSA（3%NaCl）瓊脂購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；纖維素酶（3 U/mg）、脂肪酶（20 U/mg）、蛋白酶k（30 U/mg）購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器及試劑

PBS緩沖液、結(jié)晶紫、醋酸鈉緩沖液、96孔板、全自動(dòng)高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，國(guó)華電器有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；掃描電鏡，德國(guó)ZEISS公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備

從-80℃冰箱中取出保存的副溶血弧菌VIB461菌株在2216E瓊脂平板上活化，挑取單菌落至含3%NaCl TSB，過(guò)夜活化后，按1%的比例接種于新鮮的含3%NaCl TSB中，30℃、180 rpm/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至菌液濃度為108 CFU/mL。

1.2.2復(fù)合生物酶生物膜降解酶對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制

將制備好的菌懸液按1%的接種量與酶以1:3的比例加入到96孔板中，同時(shí)設(shè)酶的對(duì)照組。將96孔板放置于30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.3副溶血弧菌生物膜的測(cè)定

采用結(jié)晶紫染色方法，取出孔板，棄去游離菌，用300μL無(wú)菌生理鹽水清洗3次，然后60℃干燥固定15 min，再每孔加入0.1%的結(jié)晶紫溶液300μL，染色15 min，用300μL無(wú)菌生理鹽水清洗3次，干燥后加入95%的無(wú)水乙醇300μL，放置10 min，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，抑制率計(jì)算參考下式：

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k濃度對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響，采用二倍稀釋法將單酶進(jìn)行稀釋，按1.2.2的方法加入到菌液中培養(yǎng)，設(shè)定相應(yīng)的對(duì)照組，采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜的抑制率。

1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以最優(yōu)纖維素酶濃度（A）、脂肪酶濃度（B）、蛋白酶k濃度（C）、自變量，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[16]，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以生物膜抑制率為響應(yīng)值，優(yōu)化三種酶的濃度并組成最佳酶組合。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.6 304不銹鋼上生物膜的菌落計(jì)數(shù)

菌落計(jì)數(shù)：將304不銹鋼片切割為長(zhǎng)2 cm寬1 cm的長(zhǎng)方形，滅菌后加入到菌液中，按1.2.2方法培養(yǎng)24 h后小心取出，將PBS清洗后的不銹鋼片放入5 mL的生理鹽水中，在20%功率的超聲波振蕩器中振蕩10 min，計(jì)算不銹鋼上生物膜活菌數(shù)。

1.2.7 304不銹鋼上生物膜的結(jié)晶紫染色

在含有TSB培養(yǎng)基和不銹鋼片試管中，將制備好的108 CFU/mL的菌懸液按1%的接種量與酶以1:3的比例加入，180 r/min培養(yǎng)24 h，取出不銹鋼片。用1.2.3的方法測(cè)定生物膜形成。

1.2.8掃描電鏡觀察304不銹鋼上的生物膜

在含有TSB培養(yǎng)基和不銹鋼片試管中，將制備好的108 CFU/mL的菌懸液按1%的接種量與酶以1:3的比例加入，180 r/min培養(yǎng)24 h，取出不銹鋼片，用PBS沖洗兩遍，加入2.5%戊二醛固定液在4℃條件下固定12 h，經(jīng)過(guò)漂洗、乙醇逐級(jí)梯度脫水、干燥、裝樣后，在掃描電鏡下觀察。

1.2.9數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)行多重比較，p<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1不同濃度纖維素酶對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用

運(yùn)用不同濃度的纖維素酶研究纖維素酶濃度對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用，如圖1所示，隨著纖維素酶濃度的增加，副溶血弧菌生物膜的抑制率逐漸上升，當(dāng)纖維素酶濃度為1.50 mg/mL時(shí)，生物膜抑制率達(dá)到做高為81.94%，之后趨于平緩，說(shuō)明在纖維素酶濃度較低時(shí)生物膜的抑制率對(duì)纖維素酶濃度依賴性增加，但纖維素酶濃度到達(dá)1.50 mg/mL之后，抑制率沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。Nguyen等研究發(fā)現(xiàn)，與低濃度相比，遞增濃度的DNase I不會(huì)更多抑制單增李斯特菌生物膜的形成[17]，本研究中，與低于1.50 mg/mL相比，遞增濃度的纖維素酶不會(huì)抑制更多的副溶血弧菌生物膜的形成，與之前的研究結(jié)果相符，因此選擇纖維素酶濃度的最佳點(diǎn)為1.50 mg/mL。

2.1.2不同濃度脂肪酶對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用

采用纖維素酶同樣的方法對(duì)脂肪酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。隨著脂肪酶濃度的增加，生物膜的抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，Lefebvre等人研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶反而增加了熒光假單胞菌的代謝活性，并且表明所選擇的酶在生物膜控制中的作用是適度的，因此，我們猜測(cè)，脂肪酶在培養(yǎng)生物膜后期會(huì)出現(xiàn)抑制率降低的情況，需進(jìn)一步研究[18]。在脂肪酶濃度為1.50 mg/mL時(shí)，副溶血弧菌生物膜抑制率達(dá)到最高值60.21%，因此選擇脂肪酶濃度為1.50 mg/mL。

2.1.3不同濃度蛋白酶k對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用

蛋白質(zhì)酶k對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用如圖3所示，隨著蛋白酶濃度的增加，副溶血弧菌生物膜的抑制率逐漸上升，當(dāng)?shù)鞍酌?/span>k濃度為2.00μg/mL時(shí)，生物膜抑制率達(dá)到做高為58.96%，之后趨于平緩，說(shuō)明在濃度較脂肪酶濃度較低時(shí)生物膜的抑制率對(duì)蛋白酶k濃度依賴性增加，但纖維素酶濃度到達(dá)2.00μg/mL之后，抑制率沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。Nguyen等人研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶k濃度到達(dá)一定數(shù)值后，其對(duì)李斯特菌生物膜的清除率不再增加[17]。與前人對(duì)蛋白酶k的研究相比，本研究中的蛋白酶k濃度也會(huì)在一定數(shù)值后其作用不再增加，但由于作用的細(xì)菌不同，蛋白酶k的最佳濃度也不同，因此，在本研究中選擇蛋白酶k濃度的最佳點(diǎn)為1.50 mg/mL。

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

采用Design-Expert軟件，分別對(duì)纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k三個(gè)對(duì)副溶血弧菌生物膜抑制效果進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果如表2所示。確定生物膜抑制率對(duì)以上因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=89.11-0.53A-0.56B-0.099C+0.24AB-0.045AC+0.50BC-0.29A2-0.80B2-0.21C2由方差分析表3可知，實(shí)驗(yàn)選用的模型p<0.0001，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.5568>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合度好；模型的校正系數(shù)RAdj=0.9498，表明該模型可以評(píng)價(jià)94.98%生物膜抑制率的變化。R=0.9780，表明實(shí)驗(yàn)誤差小，該模型適合分析纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k三種酶對(duì)VP生物膜抑制的影響。通過(guò)F檢驗(yàn)結(jié)果可知，各種酶對(duì)生物膜影響的主次順序?yàn)?/span>B>A>C，即脂肪酶對(duì)響應(yīng)值的影響最大，其次是纖維素酶，最后是蛋白酶k。模型中一次項(xiàng)A、B對(duì)響應(yīng)值的影響均為極顯著（p<0.01），模型中交互項(xiàng)AB、BC對(duì)相應(yīng)值的影響為顯著（p<0.05），AC對(duì)相應(yīng)值的影響為不顯著（p>0.05）。

2.2.2響應(yīng)面分析

通過(guò)纖維素酶與脂肪酶（AB）、纖維素酶與蛋白酶k（AC）、脂肪酶與蛋白酶k（BC）的響應(yīng)面圖可以看出（圖4所示），脂肪酶與蛋白酶k（BC）響應(yīng)面彎曲程度最大，表明兩者交互作用最明顯，脂肪酶和蛋白酶k對(duì)生物膜的抑制作用可以相互促進(jìn)；纖維素酶與脂肪酶（AB）響應(yīng)面彎曲程度次之，表明兩者交互作用次之；最后是纖維素酶與蛋白酶k（AC），兩者響應(yīng)面較平坦，交互作用不明顯。這與方差分析結(jié)果相吻合。

2.2.3最佳復(fù)合酶驗(yàn)證

利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化，通過(guò)響應(yīng)曲面分析，確定獲得生物膜抑制率最大值的條件為：纖維素酶濃度為1.00 mg/mL，脂肪酶濃度為1.10 mg/mL，蛋白酶k濃度為1.50 mg/mL，此時(shí)生物膜抑制率最大為89.73%，根據(jù)優(yōu)化條件得到的抑制率為89.65%，與預(yù)測(cè)基本相符，無(wú)顯著性差異。

在細(xì)菌細(xì)胞中，超過(guò)90%的生物膜基質(zhì)以三維空間結(jié)構(gòu)存在，因此，通過(guò)降解生物膜基質(zhì)是去除生物膜的有效方法，酶作為一種綠色高效的生物膜抑制劑已被廣泛應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、李斯特氏菌。如采用β-葡聚糖酶處理可顯著抑制熒光假單胞菌生物膜的形成[20]，采用Benzonase處理可使金黃色葡萄球菌生物膜抑制率達(dá)79.80%。由于生物膜基質(zhì)包含蛋白質(zhì)、DNA和多糖等多種組分，單一酶降解生物膜有其局限性。蛋白酶k只降解蛋白質(zhì)類物質(zhì)、纖維素酶只降解多糖類物質(zhì)、脂肪酶只降解脂類物質(zhì)，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上采用生物膜降解酶復(fù)合，利用纖維素酶、蛋白酶k、脂肪酶的交互作用，打破單一酶降解的局限性，顯著提升了副溶血弧菌生物膜的降解率，為副溶血弧菌的有效控制提供了理論基礎(chǔ)。

2.3組合酶對(duì)304不銹鋼上生物膜的抑制作用

2.3.1結(jié)晶紫染色與菌落計(jì)數(shù)

由于副溶血弧菌常常存留在某些食品接觸面上，如聚苯乙烯、食品級(jí)不銹鋼等，因此，復(fù)合酶優(yōu)化的過(guò)程是以聚苯乙烯為載體，為了研究復(fù)合酶對(duì)副溶血弧菌生物膜在不同載體上的抑制效果，我們?cè)黾恿艘圆讳P鋼為載體的研究，結(jié)果如圖5所示，通過(guò)結(jié)晶紫染色和菌落計(jì)數(shù)可以看出，復(fù)合酶處理使304不銹鋼上副溶血弧菌的生物膜上的細(xì)菌數(shù)量顯著降低，使生物膜的厚度顯著降低。

有研究表明，生物膜的形成與生物膜內(nèi)的嵌入細(xì)菌之間存在顯著的相關(guān)性，林鐲等人發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量隨著Benzonase酶濃度的升高而降低，而其生物膜的厚度也隨之降低[21]。Melvin等人發(fā)現(xiàn)0.70 mm香芹酚可以減少2.0 lg(CFU/mL)的沙門氏菌在不銹鋼表面的附著，因此得出香芹酚導(dǎo)致細(xì)菌附著減少?gòu)亩�形成較弱的生物膜[22]。Harmsen等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶K對(duì)玻璃片上李斯特菌附著的生物膜沒(méi)有顯著作用，而Nguyen等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶k可以顯著降低李斯特菌在不銹鋼上的附著[17]。前人的研究表明了抑制細(xì)菌在不銹鋼上的附著可以抑制細(xì)菌在不銹鋼上生物膜的形成，在本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合酶同樣可以減少2.3 lg(CFU/mL)的副溶血弧菌在不銹鋼表面的附著，可以顯著的抑制304不銹鋼上副溶血弧菌的生物膜形成。但由于細(xì)菌種類不同，與前人研究結(jié)果相比，不同的酶作用效果也不一樣，而復(fù)合酶除降解生物膜基質(zhì)之外是否還通過(guò)其他作用抑制生物膜的形成，這還需進(jìn)一步研究。

2.3.2掃描電鏡觀察

通過(guò)掃描電鏡，我們可以清楚的看到細(xì)菌粘附在不銹鋼上的狀態(tài)及復(fù)合酶的抑制效果。如圖6所示，對(duì)照組細(xì)菌可以大量黏附在不銹鋼上，并形成局部的生物膜(6a)，經(jīng)過(guò)復(fù)合酶的處理后，只有個(gè)別細(xì)菌粘附在不銹鋼板上，沒(méi)有形成生物膜(6b)。Cai等人通過(guò)掃描電鏡可以清晰的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)酸性電解水處理的熒光假單胞菌生物膜被分離，被分解成小的胞外基質(zhì)聚集體，胞外基質(zhì)和細(xì)菌黏附數(shù)量相比于未處理組顯著減少，酸性電解水可以有效的抑制熒光假單胞菌生物膜的形成。Lekbach等人通過(guò)掃描電鏡可以觀察到經(jīng)過(guò)丹參提取物處理的在不銹鋼上的銅綠假單胞菌生物膜由原來(lái)的緊密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變?yōu)橄∷傻男【奂�體，并且菌體形態(tài)發(fā)生變化，內(nèi)溶物外滲，由此發(fā)現(xiàn)丹參提取物可能通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜從而抑制銅綠假單胞菌在不銹鋼生物膜上的形成[25]。Nguyen等人通過(guò)掃描電鏡圖發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，200μg/mL蛋白酶k能完全去除李斯特菌在不銹鋼上的生物膜，在本實(shí)驗(yàn)中，從圖6可以看出含有蛋白酶k的復(fù)合酶雖然能有效降低不銹鋼上副溶血弧菌的黏附及胞外聚集體的形成，但卻不能完全清除生物膜，這可能是由于不同細(xì)菌生物膜胞外基質(zhì)的種類不同，各類基質(zhì)的含量也不同造成的，這說(shuō)明，在副溶血弧菌生物膜基質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量要比李斯特菌含量少，先前已有研究發(fā)現(xiàn)DNA酶I抑制和分散金黃色葡萄球菌生物膜，但對(duì)表皮葡萄球菌生物膜無(wú)效。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的復(fù)合酶是可以有效降低副溶血弧菌在食品加工器皿上的附著滋生，進(jìn)一步提升食品安全性。

3結(jié)論

本研究通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化確定纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶濃度復(fù)合其濃度分別為1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.5 mg/mL，在該條件下，復(fù)合膜對(duì)副溶血弧菌生物膜抑制率可達(dá)89.73%，但載體不同，復(fù)合酶的抑制效果不同，其掃描電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了抑制效果，這為以生物膜基質(zhì)為靶點(diǎn)的致病菌控制策略提供了理論依據(jù)。